н.с. Iва ст. Д-р В. Манолова, проф. С. Кюркчиев

ВЪВЕДЕНИЕ

Възможността за замяна, възобновяване, възстановяване или изграждане отново на увредени органи и тъкани в човешко тяло през последните години става все по-популярна всред широката общественост. Големите постижения в областта на генетиката, молекулярната биология, имунологията, както и внедряването на новите технологии в медицината дават широко поле за научно изследователска и приложна дейност в тази насока. На територията на изследователските лаборатории се търсят нови пътища и начини за реализиране на тази възможност като основен обект на изследвания са т.нар. стволови клетки. Всичко това представлява същината и основата на регенеративната (възстановителна) медицина, която е наука на бъдещето.

Целите за тази нова насока в медицината са твърде разнообразни и обхващат области като лечение на дегенеративни заболявания на нервната система (болест на Паркинсон, болест на Алцхаймер), сърдечно-съдови заболявания (сърдечен инфаркт, атеросклеротични промени на съдовете), онкологични и хематологични заболявания (левкемии), ендокринни заболявания (захарен диабет), генетични заболявания (таласемия, анемия на Фанкони), травматични и ортопедични заболявания. Не по-малко внимание и усилия се посвещават на възможността за коригиране на кожни дефекти след травми, както и корекции с козметични цели. Списъкът на областите, обхванати от регенеративната медицина постоянно се увеличава с нови болестни единици.

Най-краткото определение за стволови клетки гласи, че те са клетки, които притежават способността да се самовъзпроизвеждат и да се диференцират в различни тъкани. По отношение на типа клетъчно делене като основен физиологичен процес стволовите клетки се характеризират със симетрично делене, което осигурява самообновяването им и с асиметрично делене, което осигурява потенциала за диференциация. При симетричното делене, след завършване на митотичния процес се получават две дъщерни клетки, които са еднакви на майчината клетка и помежду си и са недиференцирани т.е. подържа се постоянен набор от недиференцирани клетки. При асиметричното делене една от дъщерните клетки навлиза в цикъл на диференциация т.е. активират се нови гени, проявяват се нови черти на клетката. Животът и съдбата на стволовите клетки са най-добре изследвани в процеса на хемопоезата. Процесите на диференциация преминават в строго определена йерархична последователност, като всяка стъпка се характеризира с фенотипни промени, които отразяват вътрешните промени в клетката. Тази иерархична последователност включва преминаване на клетката от недиференцирано състояние през последователни стадии на диференцираност до пълна степен на диференциация, изпълнение на дадена функция и гибел на клетката. В процеса на хемопоезата тази насока на развитие на клетката е необратима при нормални състояния, като увеличаване на степента на диференциация е пряко свързана с намаляване на способността за пролиферация на клетката.

Стволовите клетки се разделят на два основни типа в зависимост от тъканта от която произхождат, срока на който са идентифицирани и техните възможности за самообновяване и диференциация - ембрионални стволови клетки (ЕСК) и следембрионални стволови клетки (ССК).

ЕМБРИОНАЛНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ (ЕСК)

ЕСК се изолират от ембриона, който е достигнал стадия на бластоцист. Кухината на бластоциста се оформя на 5-ия ден след оплождането. Структурата на бластоциста е изградена от плоски клетки, образуващи трофектодерма и малки кръгли клетки, събрани в единия полюс на кухината, които формират вътрешната клетъчна маса (ICM) и бластоцел (кухина) изпълнена с течност. Човешки ембрионални стволови клетки се получават след отделяне на вътрешната клетъчна маса (inner cell mass) с последващо култивиране ин витро в присъствие на специфични растежни фактори и слой от подхранващи клетки (feeder cells). ЕСК имат потенциал за пролиферация и диференциация в клетки, произлизащи от трите зародишеви слоя. Нещо повече, редица автори доказват широките възможности за диференциация на ЕСК в специфични клекти например бета-клетки секретиращи инсулин, нервни клетки и др. и определят ЕСК като тотипотентни т.е. имащи способност за диференциация във клетки, произхождащи от всички зародишеви слоеве, включително герминативни клетки. ЕСК могат да се делят като запазват състоянието си на недиференцираност и възможността да се диференцират в поне 216 вида клетки в човешкия организъм при подходящи условия. Прилагането на ЕСК в клиничната практика се посреща с редица възражения, които имат предимно етични, морални и правни основания. Именно тези въпроси доведоха до фактическото ограничаване на научните изследвания с използване на ЕСК в САЩ и до изнасяне на подобни изследвания в страни с по-либерален режим.

[нагоре]

СТВОЛОВИ КЛЕТКИ В СЛЕДЕМБРИОНАЛНИЯ ПЕРИОД (ССК)

Сравнително неотдавна бяха съобщени редица данни, които доказват, че клетки които имат в различна степен проявени свойства на стволови клетки могат да бъдат изолирани от различни органи на възрастния индивид (adult stem cells, ASC). Подобни клетки са изолирани и характеризирани от костен мозък, кръв от плацента, централна нервна система, кожа, черва, мускул, черен дроб, плацента, тестис и т.н. Очевидно свойството "стволовост" обхваща характеристики на клетката, които са със значително по-широк обхват отколкото принципите, формулирани на основата на началните факти от изследвания на хемопоезата. Постепенно се оформя цялостна концепция за стволовите клетки, според която самата стволова клетка следва да се разглежда като единица на развитието, на регенерацията, на еволюцията (Weissman, 2000).

Значителните успехи на имунологията и имунохематологията постигнати след въвеждането на методите на имунофенотипизация на кръвните клетки позволиха разкриването на факти, които дават основание да се твърди, че в костния мозък в следембрионалния период се съдържат две основни популации от стволови клетки, които са хемопоетични стволови клетки (ХСК) и стромални или мезенимни стволови клетки (МСК).

[нагоре]

ХЕМОПОЕТИЧНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ

Хемопоетичните стволови клетки (ХСК) са характеризирани в големи подробности по отношение на насоката, хода и последователните стъпки на диференциацията им, както и фенотипните промени на всеки етап на диференциацията. В действителност, ХСК в костния мосък са единствените следембрионални стволови клетки, които могат да бъдат изолирани като се използват експресирани маркери, разпознавани от специфични антитела.

Установено, че съществуват поне две популации ХСК. Едната включва най-незрелите, дългоживеещи стволови клетки, които поддържат своята численост за сметка на пролиферацията. Те запазват през целия живот способността си да се самообновяват. Другата популация се състои от т.н. прогениторти клетки, които живеят кратко (не повече от 8 седмици). Те имат способността бързо да се диференцират и дават начало на функционално активните клетки на кръвта и имунната система. Прогениторните клетки обезпечават бързо възстановяване на имунните функции в организма на реципиента след миелоаблация по повод на хематологично заболяване. Стволовите клетки са отговорни за формиране на всички самоподдържащи и саморегулиращи функции на кръвотворната система.

Хемопоетичните прогениторни клетки дават началото на зрелите клетки на кръвта - гранулоцити, моноцити, мегокариоцити и еритроцити, поради което те се наричат още колониобразуващи единици. Колкото повече различни линии на диференциация може да продуцира клетката предшественик, толкова по-незряла е тя. Способността на хемопоетичните стволови клетки да поддържат кръвотворенето по пътя на постоянна пролиферация и диференциация е много важна при костномозъчна трансплантация. Ето защо трансплантатът трябва да съдържа много незрели полипотентни стволови клетки, които могат да се диференцират както в лимфоидно така и в еритроидно и миелоидно направление. Освен това тези клетки трябва да имат способността сами да поддържат себе си.

Особеност на хемопоетичните стволови клетки е експресията на специфичен антиген на тяхната повърхност обозначен със символа CD34. Клетки с имунофенотип CD34 притежават висока пролиферативна и колоногенна активност, и затова този антиген се счита за най-разпространения и важен маркер на стволовите клетки.

[нагоре]

МЕЗЕНХИМНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ

Костният мозък е изграден от три основни клетъчни системи - хемопоетични, ендотелни и стромални, като последното определение се отнася до не съвсем точно определени клетки, които поддържат хемопоезата. При култивиране суспенсия от костен мозък ин витро за продължителни периоди от време се наблюдават прилепващи към твърда повърхност удължени клетки, които се определят като фибробластни клетки.

Многобройни изследвания показват, че именно тези клетки могат да се диференцират в различни типове клетки, като остеогенни, хондрогенни, адипогенни и др., поради което те се определят като мезенхимни стволови клетки (МСК). Мезенхимните стволови клетки изглеждат почти неуловими в сравнение с ХСК, защото все още няма идентифициран маркер, който да позволи тяхното изолиране в суспенсия или разпознаването им ин витро. Това обстоятелство дава основание на някои автори да поставят въпроса дали МСК въобще съществуват в костния мозък или те са просто артефакт получен след дедиференцирането на клетките при култивиране ин витро и придобиват черти на "стволовост". Обща характеристика на МСК е, че те се изолират чрез относително проста лабораторна процедура, която се основава на тяхната способност да прилепват към твърда повърхност и да растат ин витро като морфологично се определят като фибробласто-подобни клетки.

[нагоре]

НЕРВНИ СТВОЛОВИ КЛЕТКИ (НСК)

Морфолозите, които изследват задълбочено нервната система твърдят от дълго време, че не е вярно твърдението за невъзможността да се образуват нови неврони в следембрионалния период от живота на организма, включително човека. Altman and Das (1966) описват факта, че нови неврони се образуват през целия живот в някои обособени места на мозъка като обонятелната луковица и хипокампа. Най-често използвания източник за изолиране на НСК са части от субвентрикуларната зона на главния мозък и хипокампа, в които ин виво се откриват делящи се клетки. След получване на едноклетъчна суспенсия по различни способи, клетките се култивират в присъствие на сравнително високи дози растежни фактори - епидермален растежен фактор или фибробластен растежен фактор за поддържане на клетките в недифернцирано състояние и за получаване на голям брой клетки, които могат да бъдат замразявани за дълготрайно съхранение.

[нагоре]

СТВОЛОВИ КЛЕТКИ В ПЛАЦЕНТАРНАТА КРЪВ

В края на 80-те години на миналия век беше доказано, че плацентарната кръв съдържа хемопоетични стволови клетки, които биха могли да заместят костния мозък като източник на клетки за трансплантация. Първият докладван случай е преливането на клетки от плацентарна кръв на дете с анемия на Фанкони (1988), което води до повишаване на интереса към тези клетки. Според литературните данни, в днешни дни ХСК от плацентарна кръв са преливани на повече от 2000 пациенти за лечение на 45 болестни състояния. Може да се каже, че понастоящем кръвта от плацента е един достоен алтернативен източник на стволови клетки за трансплантация при много тежки заболявания на кръвта и наследствени нарушения на метаболизма. В подкрепа на това мoже да бъдат изложени следните факти:

Прилагането на полихимиотерапия при лечението на злокачествените кръвни заболявания води до продължителна аплазия на костномозъчното кръвотворене. Източник на хемопоетични стволови клетки за трансплантация може да бъде костен мозък от генетично идентичен близнак, алогенен костен мозък от HLA съвместим донор, автоложен костен мозък стволови клетки от периферна кръв на болния и плацентарна кръв. Идеалните донори на костен мозък са идентичните донори близнаци. Обаче тази възможност я имат единични болни. Ако сред родствениците няма HLA - идентичен донор, в някои случаи може да се използва костен мозък от неродствен донор, съвместим по HLA системата. Но поради голямия полиморфизъм на HLA системата, вероятността неродствения донор да е HLA съвместим е много малка. Освен това подготовката на донора е дълъг процес, тъй като трябва да се извършат редица хематологични, имунологични и вирусни изследвания с обща средна продължителност около 135 дни. През този дълъг период на изчакване пациентът може и да не доживее до трансплантация. Освен това, намирането на донора, изследванията и подготовката на костния мозък за трансплантация е скъпо струващ процес от 25000 до 50000 долара. За етнически малцинства вероятността за намиране на HLA съвместим неродствен донор е изключително малака. Използването на автоложен костен мозък и стволови клетки от периферна кръв крие потенциалната опасност от възможна контаминация със злокачествени клетки при трансфузията. Споменатите трудности и ограничения при използването на костен мозък пораждат необходимостта от намирането на алтернативни източници на хемопоетични стволони клетки един от които се явява кръвта от плацента.

Още през 70-те години стана ясно, че плацентарната кръв съдържа много по-голямо количество стволови клетки и клетки предшественици в сравнение с кръвта на възрастните и на децата. Използването на плацентарната кръв за получаване и трансплантация на стволови клетки има редица преимущества в сравнение с другите източници на хемопоетични стволови клетки:

• Събирането на плацентарна кръв е безопасна и технически лесна процедура, абсолютно безопасна за майката и новороденото;
• Замразените стволови клетки тествани и типизирани по HLA-системата могат веднага да бъдат използвани за трансплантация;
• Увеличава се вероятността да се намерят редки HLA типове трансплантати за етнически малцинства;
• Значително се намалява рискът от предаване на някои латентни инфекции предавани по трансмисивен път, където вероятността от носителство е значително по-ниска отколкото при възрастните;
• Може да се използват не напълно съвместими по HLA трансплантати;
• Честотата на развитие и тежестта на реакция трансплантат срещу хазаин е по-ниска в сравнение с тази при трансплантация на костен мозък;
• Плацентарната кръв съдържа по-ефективни хемопоетични клетки в сравнение с костния мозък т.е. по-малъкй брой клетки са необходими за постигане на желания терапевтичен ефект.
• Стволовите клетки от плацентарна кръв могат да се използват и за автоложна трансплантация при нужда.

В заключение плацентарната кръв понастоящем трябва да се разглежда като богат източник на хемопоетични стволови клетки подходящи за трансплантация. Възможността за широко приложение на плацентарната кръв като източник на хемопоетични стволови клетки наложи създаването на специални хранилища - Тъканни банки за плацентарна кръв, в които клетките се съхраняват дълго време без загуба на трансплантационния потенциал. В тези банки се съхраняват реални образци, готови за трансплантация непосредствено след размразяване. Тъканните банки за получаване и съхранение на замразени хемопоетични стволови клетки от плацентарна кръв решават проблема с намирането на подходящия трансплант и своевременното му използване при нужда. Стволовите клетки са основа за разработване на нови подходи за лечение на различни заболявания. В бъдеще ще бъде възможно тяхното култивиране ин витро и насочване в необходимата насока на диференциация, като по този начин се осигурява достатъчен брой клетки, осигуряващи заместването на увредени клетки. По този начин ще е възможно да се възстанови функцията на засегнатите органи и да се осигури продължителен живот при добро здравословно състояние.

[нагоре]

Групи заболявания при които се прилага трансплантация на стволови клетки от кръв от пъпна връв (плацентарната кръв):

• Хронична левкоза;
• Миелодиспластичен синдром;
• Болести свързани с патология на стволовите клетки - апластична анемия, анемия на фанкони, пароксизмална нощна хемоглобинурия;
• Болести свързани с нарушения в пролиферацията на миелоидния растеж - -остра и идиопатична миелофиброза, полицитемия вера, есенциална тромбоцитемия;
• Лимфопролиферативни разстройства - Хочкинов лимфом и нехочкинов лимфом;
• Фагоцитарни дисфункции;
• Хистиоцитарна дисфункция;
• Наследствени нарушения на метаболизма;
• Наследствени аномалии на еритроцитите - бета таласемия, сърповидноклетъчна анемия;
• Наследствени разстройства на имунната система;
• Тромбастения на Гланцман;
• Макроглобулинемия на Валденщрьом;
• Други наследствени заболявания

[нагоре]